Bioassay-Guided Isolation and Analysis of Phytochemicals with Endocannabinoid Activity in Achillea millefolium L.

Abstract

This thesis used bioassay-guided fractionation to investigate the bioactivity and phytochemistry of Achillea millefolium L. (yarrow, Asteraceae) roots, flowerheads, and leaves. We also provided a validated analytical high-pressure liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) method for detecting and quantitating yarrow metabolites. A general literature review encompassed the biological, ethnobotanical, and bioactive diversity of A. millefolium, but revealed gaps in the knowledge surrounding yarrow's bioactivity with the endocannabinoid system (ECS). Chiefly, we investigated yarrow's potential to inhibit fatty acid amide hydrolase (FAAH) and monoacylglycerol lipase (MAGL), two enzymes which degrade ligands of the ECS. Crude and liquid extracts of yarrow plant parts Inhibited both FAAH and MAGL in vitro, and showed a higher selectivity towards FAAH - a trend upheld throughout bioassays. Organic fractions of roots and flowerheads were sub-fractionated and yielded isolated compounds that inhibited FAAH and MAGL. Root isolates were alkylamides (AKAs), and pellitorine had the lowest half-maximal inhibitory concentrations (IC50) toward FAAH (26.45 µg/mL). Deca-2E,4E,8Z-trienoic acid piperideide was the most potent MAGL inhibitor (IC50=48.92 µg/mL). Flowerhead isolates did not show activity towards FAAH but minimally did so towards MAGL. Dihydroparthenolide inhibited MAGL the most of all isolated compounds (IC50 26.18 µg/mL). The accurate masses of all isolated compounds and the fragmentation patterns for the most inhibitory compounds were acquired using mass spectrometry (MS). CQA chemical standards were used instead of pursuing their isolation. 1,3-dicaffeoylquinic acid (DCQA) inhibited FAAH and MAGL the most across all tested standards and isolates (54.35% at 5 µg/mL and 45.78% at 10 µg/mL for FAAH and MAGL, respectively). Using reference standards and isolated compounds, we then validated an analytical HPLC-DAD method developed for detecting and quantitating metabolites in A. millefolium. Results showed that roots, flowerheads, and leaves collected in October had more metabolites accumulated than samples from May. Roots mainly contained AKAs, which were unique to them, dihydroparthenolide was only quantified in the flowerheads and was the most abundant of all (44.78 mg/g dry weight), and leaves contained the most chlorogenic acid (30.5 mg/g dry weight). Results showed good linearity, precision, and repeatability of the method. This thesis provided novel data for the potential of yarrow plant parts, their fractions, and isolated compounds to inhibit FAAH and MAGL, reinforcing their high regard as a medicinal plant in the ethnobotany of North America. Coupled with an analytical method that can be applied to yarrow and other plant species showing similar phytochemistry, it will also help streamline future research into yarrow's metabolites. --

Cette thèse a utilisé le fractionnement bio-guidé pour étudier la bioactivité et la phytochimie des racines, capitules et feuilles d'Achillea millefolium L. (achillée millefeuille, Asteracées). Nous avons également fourni une méthode analytique validée de chromatographie liquide haute pression avec détecteur é réseau de diodes (HPLC-DAD pour la détection et la quantification des métabolites de l'achillée. Une revue générale de la littérature a couvert la diversité biologique, ethnobotanique et bioactive d'A. millefolium, mais a révélé des lacunes dans la connaissance de la bioactivité de l'achillée en lien avec le système endocannabinoïde (SEC). Principalement, nous avons étudié le potentiel de l'achillée à inhiber l'amidase d'acide gras (FAAH) et la lipase monoacylglycérol (MAGL), deux enzymes qui dégradent les ligands du SEC. Les extraits bruts et liquides des différentes parties de la plante d'achillée ont inhibé à la fois FAAH et MAGL in vitro, avec une plus grande sélectivité pour FAAH - une tendance maintenue tout au long des bioessais. Les fractions organiques des racines et des capitules ont été sous-fractionnées et ont produit des composés isolés inhibant FAAH et MAGL. Les isolats des racines étaient des alkylamides (AKAs), et la pellitorine avait la concentration inhibitrice médiane (IC50) la plus faible pour FAAH (26,45 µg/mL). L'acide déca-2E,4E,8Z-triènoïque pipéridéide était l'inhibiteur le plus puissant de MAGL (IC50 = 48.92 µg/mL). Les isolats des capitules n'ont montré aucune activité envers FAAH mais ont légèrement inhibé MAGL. La dihydroparthénolide a montré l'inhibition la plus marquée de MAGL parmi tous les composés isolés (IC50 26,18 µg/mL). Les masses précises de tous les composés isolés et les schémas de fragmentation des composés les plus inhibiteurs ont été obtenus par spectrométrie de masse (MS). Les standards chimiques d'acides caféoylquiniques (CQA) ont été utilisés au lieu de les isoler. L'acide 1,3-dicaffeoylquinique (DCQA) a inhibé FAAH et MAGL plus que tous les autres standards et isolats testés (54,35 % à 5 µg/mL et 45,78 % à 10 µg/mL pour FAAH et MAGL, respectivement). En utilisant des standards de référence et des composés isolés, nous avons ensuite validé une méthode analytique HPLC-DAD développée pour la détection et la quantification des métabolites dans A. millefolium. Les résultats ont montré que les racines, les capitules et les feuilles collectés en octobre contenaient davantage de métabolites accumulés que les échantillons de mai. Les racines contenaient principalement des AKAs, qui leur étaient uniques, la dihydroparthénolide n'était quantifiée que dans les capitules où elle était la plus abondante de tous les métabolites (44,78 mg/g de poids sec) et les feuilles contenaient le plus d'acide chlorogénique (30,5 mg/g de poids sec). Les résultats ont montré une bonne linéarité, précision et répétabilité de la méthode. Cette thèse fournit des données inédites sur le potentiel des différentes parties de la plante d'achillée, de leurs fractions et des composés isolés pour inhiber FAAH et MAGL, renforçant leur haute estime en tant que plante médicinale dans l'ethnobotanique de l'Amérique du Nord. Associée à une méthode analytique applicable à l'achillée et à d'autres espèces végétales présentant une phytochimie similaire, elle contribue également à faciliter les futures recherches sur les métabolites de l'achillée.