Anaerobic Fluorescent Reporters for Studying Pseudomonas aeruginosa-Specific Responses in a CF Polymicrobial Assay

Abstract

Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that persists in the hypoxic and anaerobic microenvironments characteristic of the cystic fibrosis (CF) airways, where it often exists as part of polymicrobial communities and forms biofilms that contribute to chronic infections. Studying P. aeruginosa under these conditions is complicated by the limited availability of tools for monitoring bacterial behaviour and a lack of experimentally validated in vitro models that capture relevant interspecies interactions. This thesis addresses these gaps by developing oxygen-independent fluorescent reporters, implementing and validating an anaerobic CF polymicrobial model, and engineering a stable reporter strain that was used to study the spatial distribution of P. aeruginosa in multi-species biofilm systems. In Chapter 2, I designed a suite of fluorescent reporters, including phiLOV2.1 and FAST. I demonstrated their functionality in monitoring P. aeruginosa under low-oxygen or anaerobic conditions. Furthermore, I showed that phiLOV2.1 and FAST could also be used in dual-culture imaging to monitor P. aeruginosa subpopulations. The broad host range of these reporters allows adaptation to diverse Gram-negative bacteria to enable real-time visualization in biofilms and other hypoxic niches. In Chapter 3, I implemented and validated a CF polymicrobial model system incorporating P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis, and Prevotella melaninogenica. Using this anaerobic multi-species assay, I assessed the persistence of six P. aeruginosa deletion mutant strains. I evaluated their susceptibility to tobramycin across a range of concentrations in the context of complex interspecies interactions. The mutant ΔtctED had the strongest phenotype, being the most susceptible strain compared to the wild type. This finding highlights tctED as a biofilm-specific antibiotic resistance gene under conditions that closely approximate those present in the CF lung environment. This suggests that tctED could be a potential target in combating antibiotic resistance in vivo. In Chapter 4, I engineered a stable, antibiotic-independent plasmid, pCFT4.2.1, encoding phiLOV2.1 and the VapBC toxin–antitoxin system. This construct was retained in over 90% of P. aeruginosa PA14 WT cells for at least three days without antibiotic pressure, maintaining detectable fluorescence. Within the CF polymicrobial assay, I have provided evidence that P. aeruginosa harbouring pCFT4.2.1 forms both surface-attached and biofilm-like structures resembling floating aggregates. Collectively, this work provides novel fluorescent tools, validates a relevant CF polymicrobial model system, substantiates tctED as a P. aeruginosa biofilm-specific antibiotic resistance gene under multiple conditions, establishes a stable reporter strain for tracking P. aeruginosa in anaerobic multi-species communities, and offers insights into the nature of P. aeruginosa biofilms in this assay. Altogether, these findings advance our ability to study the persistence, antibiotic susceptibility, and biofilm formation ability of P. aeruginosa in clinically relevant contexts. *** Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste qui persiste dans les microenvironnements hypoxiques et anaérobiques caractéristiques des voies respiratoires des patients atteints de fibrose cystique (CF)—une maladie génétique héréditaire marquée par la production de mucus visqueux principalement dans les poumons, ce qui conduit à des infections respiratoires chroniques. Dans le poumon CF, P. aeruginosa coexiste souvent au sein de communautés polymicrobiennes et forme des biofilms contribuant à ces infections. L’étude de P. aeruginosa dans ces conditions est complexifiée par le nombre limité d’outils permettant de suivre son comportement et par l’absence de modèles in vitro capables de reproduire les interactions interespèces pertinentes. Cette thèse vise à combler ces lacunes en développant des rapporteurs fluorescents indépendants de l’oxygène, en mettant en œuvre et en validant un modèle polymicrobien anaérobique de la CF, et en construisant une souche rapporteur stable utilisée pour étudier la distribution spatiale de P. aeruginosa dans des systèmes de biofilms multi-espèces. Au Chapitre 2, j'ai conçu une série de rapporteurs fluorescents, incluant phiLOV2.1 et FAST, et démontré leur fonctionnalité pour le suivi de P. aeruginosa en conditions hypoxiques ou anaérobiques. J’ai également montré que phiLOV2.1 et FAST pouvaient être employés pour l'imagerie en co-culture pour observer des sous-populations de P. aeruginosa. La large gamme d’hôtes compatibles avec ces rapporteurs permet leur adaptation à diverses bactéries à Gram-négatif, ouvrant la voie à une visualisation en temps réel dans les biofilms et autres niches hypoxiques. Au Chapitre 3, j’ai mis en œuvre et validé un système modèle polymicrobien de la CF intégrant P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis et Prevotella melaninogenica. À l’aide de ce système anaérobique multi-espèces, j’ai étudié la persistance de six souches mutantes de P. aeruginosa et évalué leur sensibilité à la tobramycine sur une gamme de concentrations, dans ce contexte d’interactions interespèces complexes. Le mutant ΔtctED a présenté le phénotype le plus marqué, se révélant la souche la plus sensible par rapport au type sauvage. Cette découverte met en évidence tctED comme un gène de résistance aux antibiotiques spécifique aux biofilms dans des conditions proches de celles de l'environnement pulmonaire de la CF, suggérant que tctED pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour lutter contre la résistance aux antibiotiques in vivo. Au Chapitre 4, j’ai construit un plasmide stable et indépendant des antibiotiques, pCFT4.2.1, codant pour phiLOV2.1 et le système toxine–antitoxine VapBC. Ce plasmide a été maintenu dans plus de 90% des cellules de P. aeruginosa PA14 WT pendant au moins trois jours sans pression de sélection antibiotique, tout en conservant une fluorescence détectable. Dans le cadre du modèle polymicrobien CF, l’étude de P. aeruginosa porteur du plasmide pCFT4.2.1 a permis de mettre en évidence la capacité de ce pathogène à former des biofilms adhérents à des surfaces ainsi que des agrégats flottants assimilables à des biofilms. Dans l’ensemble, ce travail fournit de nouveaux outils fluorescents, valide un modèle polymicrobien pertinent pour la CF, confirme tctED comme un gène de résistance aux antibiotiques spécifique aux biofilms de P. aeruginosa dans diverses conditions, établit une souche rapporteur stable pour étudier P. aeruginosa dans des communautés multi-espèces anaérobiques, et révèle des informations sur la nature des biofilms de P. aeruginosa dans ce modèle polymicrobien. Collectivement, ces résultats renforcent notre capacité à étudier la persistance, la sensibilité aux antibiotiques et la capacité de formation de biofilms de P. aeruginosa dans des contextes cliniques pertinents.